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Design, Synthese und Charakterisierung peptidischer Paratop-Mimetika von HIV-1 neutralisierenden Antikörpern

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Design, Synthesis and Characterization of Peptide Paratope Mimics of HIV-1 Neutralizing Antibodies

Please always quote using this URN: urn:nbn:de:bvb:29-opus4-70815
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  • Humane Antikörper, die ein breites Spektrum an HIV-1-Stämmen neutralisieren, sind wertvolle Werkzeuge zur Ermittlung potentieller Schwachstellen von HIV-1-Viruspartikeln und als Basis zur Entwicklung neuer antiviraler Verbindungen. Viele solcher Antikörper wurden bereits aus mit HIV-1 infizierten Menschen isoliert. Sie sind in der Regel gegen die Oberflächenproteine gp120 und/oder gp41 des viralen Spikes gerichtet. Leider ist es bis heute nicht gelungen, diese neutralisierenden Antikörper als Therapeutika zur Behandlung von HIV-Patienten einzusetzen. Gerade deshalb sind Anti-HIV-1-Antikörper interessante Kandidaten, um von Ihnen peptidische Mimetika abzuleiten. Eine Möglichkeit zurHumane Antikörper, die ein breites Spektrum an HIV-1-Stämmen neutralisieren, sind wertvolle Werkzeuge zur Ermittlung potentieller Schwachstellen von HIV-1-Viruspartikeln und als Basis zur Entwicklung neuer antiviraler Verbindungen. Viele solcher Antikörper wurden bereits aus mit HIV-1 infizierten Menschen isoliert. Sie sind in der Regel gegen die Oberflächenproteine gp120 und/oder gp41 des viralen Spikes gerichtet. Leider ist es bis heute nicht gelungen, diese neutralisierenden Antikörper als Therapeutika zur Behandlung von HIV-Patienten einzusetzen. Gerade deshalb sind Anti-HIV-1-Antikörper interessante Kandidaten, um von Ihnen peptidische Mimetika abzuleiten. Eine Möglichkeit zur Nachahmung ist, strukturbasiert ein Peptid vom Paratop des Antikörpers, dem Gegenstück zu seinem Epitop, abzuleiten. Für diese Arbeit wurde zunächst der Anti-HIV-1-Antikörper b12 als Templat für das Design eines peptidischen Paratop Mimetikums verwendet. Der b12-Antikörper adressiert die Bindungsstelle für den humanen Zellrezeptor CD4 auf dem viralen Hüllprotein gp120, d.h. der Antikörper inhibiert durch Bindung an sein Epitop die erste Interaktion zwischen Virus und Wirtszelle. Die Kristallstruktur von b12 im Komplex mit gp120 zeigt, dass der Antikörper nur über die CDRs seiner schweren Kette direkte Kontakte mit seinem Antigen ausbildet. Drei besonders wichtige Aminosäuren machen dabei 40 % der Antikörper-Antigen-Kontaktfläche aus: W100, Y53 und N31, welche jeweils im Zentrum einer CDR H (H3, H2 und H1) liegen. Besonders das Indolringsystem des W100, welches an der Spitze des lang herausragenden CDR H3 von b12 sitzt, wurde als essentiell für die Bindung von b12 an gp120 beschrieben. Das in dieser Arbeit beschriebene b12-Paratop-Mimetikum setzt sich folglich auch aus drei entsprechenden Sequenz-Abschnitten, CDR H1, H2 und H3, zusammen und es wird somit eine diskontinuierliche Bindungsstelle nachgeahmt. Die Proteinabschnitte zwischen den CDR-Sequenzen wurden im Peptid durch Spacer ersetzt. Die schleifenartige Struktur der CDR H3- und H2-Sequenz wurde durch Verbrückungen in Form eines Disulfids bzw. eines Lactams nachgestellt. Außerdem trug das Peptid eine Biotin-Markierung zur leichteren Präsentation bzw. Detektion im Bindungsassay (ELISA). So entstand das Leitpeptid HAM (human antibody (b12) mimic). Diese neue, potentiell antivirale Verbindung wurde mittels Fmoc/tBu-Strategie an der festen Phase synthetisiert und nach der Aufarbeitung auf ihre biologische Aktivität hin untersucht. Wie sein Eltern-Antikörper b12 war auch das b12-Paratop-Mimetikum HAM im Bindungsassay in der Lage, an gp120-Proteine b12 sensitiver HIV-1-Stämme zu binden, wohingegen gp120-Proteine b12-resistenter HIV-1-Stämme selektiv deutlich schlechter erkannt wurden. Kompetitionsversuche mit b12 scheiterten, da das Peptid an seinen Eltern Antikörper selbst bindet, möglicherweise aufgrund einer Art Autoreaktivität, wie sie häufig für breit neutralisierende Antikörper beschrieben wird. In Kompetitionsexperimenten mit CD4 konnte jedoch gezeigt werden, dass HAM mit CD4 um die Bindung an gp120 konkurriert, was ein eindeutiges Indiz dafür ist, dass das Peptid den Bereich der CD4-Bindungsstelle auf gp120, welche mit dem Epitop von b12 überlappt, adressiert. In verschiedenen HIV-1-Zellinfektionsassays war HAM ein potenter Inhibitor und neutralisierte HIV-1 mit IC50 Werten zwischen 1,0 µM und 5,0 µM. Alanin-Varianten, bei denen W100, Y53 und/oder N31 im Peptid durch Alanin ersetzt wurden, belegten, dass für HAM vor allem das W100 der CDR H3-Sequenz unentbehrlich ist für Bindung an gp120 und ebenso für seine Neutralisationsfähigkeit, entsprechend dem Eltern-Antikörper b12. Mit der Testung von scrambled Varianten von HAM konnte die Notwendigkeit der richtigen Reihenfolge der Aminosäuren im Peptid gezeigt und somit das Peptid-Design zusätzlich bestätigt werden. Versuche mit einer linearen Variante von HAM konnten beweisen, dass die Einschränkung der Flexibilität des Peptids die spezifische Interaktion zwischen Peptid und gp120 deutlich fördert. Die Daten aus Bindungsassays und Zellinfektionsassays mit sechs verkürzten Varianten von HAM gaben Aufschluss über die Rolle der einzelnen CDRs im Peptid. Es konnte gezeigt werden, dass CDR H1 entscheidend ist für die Bindung an gp120, dass aber die CDR H3 essentiell ist für eine Inhibition der Infektion von Zellen mit HIV-1. CDR H2 leistet hingegen keinen Beitrag zur biologischen Aktivität von HAM. Die verkürzte Variante (H1H3)HAM, welcher die CDR H2-Sequenz fehlt, stellte sich folglich als optimierte Variante von HAM heraus, mit vergleichbarem Bindungsverhalten an gp120-Proteine, einem leicht verbesserten Neutralisationspotential und einem schnelleren und effizienteren Syntheseweg. Um mehr Informationen zur Bindungsstelle für HAM und (H1H3)HAM auf gp120 zu erhalten wurde HIV-1 in Gegenward des b12-Antikörpers bzw. der Peptide über mehrere Wochen hinweg kultiviert, die durch den Selektionsdruck erhaltenen Viren isoliert und anschließend sequenziert. Unter dem Einfluss des b12-Antikörpers vermehrten sich ausschließlich Viren, die eine Mutation an einer für b12-Resistenzen typischen Position im b12-Epitop von gp120 trugen (V372). Nach der durch HAM, bzw. (H1H3)HAM erzwungene Selektion wurden Viren isoliert, welche Mutationen im gp120-Protein aufwiesen, die sich direkt angrenzend an das b12-Epitop befinden, bzw. im Kern des Proteins. Letzteres verändert die Tertiärstruktur von gp120 vermutlich entscheidend, sodass eine Neutralisation durch HAM bzw. (H1H3)HAM deutlich erschwert wird. Die so erhaltenen Viren zeigten sich in den anschließenden Zellinfektionsassays nämlich deutlich weniger sensibel gegenüber den entsprechend eingesetzten Inhibitoren als das Wildtyp-HIV-1. Eine kreuzweise Testung im Zellinfektionsassay von b12, HAM bzw, (H1H3)HAM mit den drei mutierten Viren zeigte auf, dass auch die Neutralisationsfähigkeit der beiden nicht zur Selektion anwesenden Inhibitoren durch die Mutationen beeinflusst wird. Dieses Resultat lässt darauf schließen, dass die Peptide an der gleichen Bindungsstelle mit gp120 interagieren wie der b12-Antikörper selbst. Desweiteren wurde nach dem Vorbild von HAM ein anderes peptidisches Mimetikum entworfen und untersucht: HAMX (human antibody (X5) mimic). Es ahmt das Paratop des X5-Antikörpers nach, welcher die Corezeptor-Bindungsstelle auf gp120, ebenfalls mit Hilfe einer auffällig langen CDR H3 Schleife, adressiert. Es wurden in den durchgeführten Experimenten mit HAMX ähnliche Ergebnisse erhalten wie mit HAM: auch HAMX bindet an gp120 und neutralisiert HIV-1 vergleichbar effektiv in den Zellinfektionsassays, diverse Varianten von HAMX bestätigten auch hier das gewählte Peptid-Design. HAMX könnte in Zukunft zum Beispiel in Verbindung mit HAM, oder (H1H3)HAM, zur Herstellung von Hybridmolekülen dienen, die simultan zwei der wichtigsten Bindungsstellen von HIV-1 gp120, die CD4-Bindungsstelle und die Corezeptor-Bindungsstelle, blockieren können. Neutralisationsversuche mit HAM- und HAMX-Peptiden an einem anderen Virus, HSV, zeigten, dass die Paratop-Mimetika darüber hinaus selektiv HIV-1 neutralisieren und nicht willkürlich Virus-Wirtszell-Interaktionen blockieren. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die gesammelten Daten alle für eine erfolgreiche Mimikry von Anti-HIV-1-Antikörpern durch die peptischen Paratop-Mimetika sprechen. Peptide besitzen demnach großes Potential zur Nachahmung von Antikörpern in deutlich kleineren Molekülen. In dieser Forschungsarbeit wurden neue, selektiv aktive HIV-1-neutralisierende Verbindungen entwickelt, die das körpereigene Immunsystem zum Vorbild haben. HAM, (H1H3)HAM, HAMX und sicherlich auch andere nach ihrem Vorbild entworfene Peptide können in Zukunft zur weiteren Erforschung von Infektionsmechanismen und zur Entwicklung neuartiger Virusinfektions-Inhibitoren mit einzigartigen Eigenschaften dienen.
  • Human antibodies which neutralize a broad range of HIV-1 isolates are valuable tools for the discovery of potential points of vulnerability on HIV-1 viral particles and as basis for the development of new antiviral agents. Many of these antibodies have already been isolated from HIV-1 infected people and they are mainly directed against the viral spike, consisting of the surface proteins gp120 and gp41. Unfortunately, scientists have not been successful in using those neutralizing antibodies for the therapy of HIV-1 infected patients so far. Therefore, they are interesting candidates for the deduction of mimetic compounds. One possibility to mimic an antibody is the structure based designHuman antibodies which neutralize a broad range of HIV-1 isolates are valuable tools for the discovery of potential points of vulnerability on HIV-1 viral particles and as basis for the development of new antiviral agents. Many of these antibodies have already been isolated from HIV-1 infected people and they are mainly directed against the viral spike, consisting of the surface proteins gp120 and gp41. Unfortunately, scientists have not been successful in using those neutralizing antibodies for the therapy of HIV-1 infected patients so far. Therefore, they are interesting candidates for the deduction of mimetic compounds. One possibility to mimic an antibody is the structure based design of peptides derived from the antibody’s paratope, which is the counterpart of its epitope. Initially in this work, the anti-HIV-1 antibody b12 was used as template for the design of a peptide paratope mimic. b12 addresses the binding site for the human cell receptor CD4 on gp120 and thus inhibits through binding to its epitope the initial interaction between virus and host cell. The crystal structure of b12 in complex with gp120 shows that the antibody makes only direct contact with gp120 via the three CDRs of its heavy chain. Three amino acids make up 40 % of the contact surface between b12 and gp120: W100, Y53 and N31, each in the center of one CDR (H3, H2 and H1). Especially the indole ring system of W100 at the tip of CDR H3 has been shown to be essential for binding of b12 to gp120. The herein described b12 paratope mimic thus also consists of three sequential parts, CDR H1, H2 and H3, and displays a discontinuous binding site. The protein sequences between these sections were replaced by spacers in the peptide. The loop like structure of CDR H3 und H2 was provided by a disulfide bridge and a lactam bridge, respectively. Furthermore, the peptide was tagged with biotin to enable an easy presentation or detection in ELISA experiments. This design approach resulted in the new lead peptide HAM (human antibody (b12) mimic). The potentially antiviral agent was synthesized via solid phase peptide synthesis using Fmoc/tBu strategy and its biologic activity was investigated after reprocessing and purification. Like its parent antibody b12, HAM bound to gp120 proteins of HIV-1 sensitive strains, whereas b12 resistant strains were selectively worse recognized. Competition experiments with b12 for binding to gp120 were not successful as HAM binds to its parent antibody b12 itself, probably due to a kind of autoreactivity which has already been described in literature for broadly neutralizing antibodies. However, competition experiments with CD4 demonstrated that HAM competes with CD4 for binding to gp120. This indicates that the peptide addresses the same binding region on gp120 as CD4 which overlaps the b12 epitope on gp120. In different HIV-1 cell infection assays HAM was able to neutralize HIV-1 with IC50 values ranging from 1.0 µM to 5.0 µM. Replacing the three most important amino acids of b12, W100, Y53 and/or N31, through alanin on peptide level revealed that also for HAM the W100 residue is most important for gp120 binding and virus neutralization. By testing scrambled variants of HAM the importance of the correct amino acid sequence and thus the peptide design could be confirmed. A linear derivative verified that conformational restrictions in order to lower the peptide’s flexibility at certain positions support a specific interaction between HAM and gp120. The results of binding assays and cell infection assays applying truncated variants of HAM gave information about the role of each CDR H for the peptide’s activity. According to the results, CDR H1 is crucial for binding to gp120 whereas CDR H3 is essential for an effective neutralization of HIV-1. CDR H2 does not contribute to the biological activity of HAM. The truncated variant (H1H3)HAM, which lacks the CDR H2, turned out to be an optimized version of HAM with comparable binding properties, a slightly better neutralization potential and a faster way of synthesis with higher yields. In order to obtain further information about the binding site for HAM and (H1H3)HAM on gp120 virus has been cultivated for several weeks in presence of b12 antibody or a peptide inhibitor. The viral species surviving under this selective pressure were isolated and sequenced afterwards. The b12 resistant viruses showed a mutation at a position (V372) in the antibody’s epitope which has been described for b12-resistant HIV-1 strains earlier. Under the impact of HAM or HAM(H1H3) the isolated viruses carried mutations at positions neighboring the b12 epitope or also in the core of gp120, respectively. The latter probably causes critical changes in the tertiary structure of the protein and thus impedes neutralization by HAM and (H1H3)HAM. In cell infection assays it could be shown that neutralization of the mutated viruses was harder for the inhibitors used for selection compared to neutralization of the wild type virus. Moreover, crosswise testing of the inhibitors b12, HAM and (H1H3)HAM in cell infection assays with the three isolated viral species depicted that also the neutralization potential of not for the selection pressure responsible inhibitors has been reduced. These results indicate that the peptides address the same region on HIV-1 gp120 for binding as their parent antibody b12 does. Additionally, another peptide paratope mimic following the model HAM has been designed and analyzed, called HAMX (human antibody (X5) mimic). It displays the paratope of X5, an antibody addressing the coreceptor binding site on gp120 also involving a long protruding CDR H3. The results obtained for HAMX were comparable to those for HAM: also HAMX did bind to gp120, neutralized HIV-1 in cell infection assays in similar concentrations and diverse variants of HAMX confirmed the peptide’s design. In the future, HAMX can probably be used to construct hybrid molecules in combination with HAM or (H1H3)HAM addressing the two main binding sites, CD4 binding site and coreceptor binding site, on gp120 simultaneously and thus effectively blocking viral entry. Further neutralization experiments with another virus, HSV, showed that the antibody paratope mimics do not randomly inhibit interactions between viruses and host cells but selectively inhibit HIV-1 infection. In summary, all collected data point towards a successful mimicry of anti-HIV-1 antibodies through peptide paratope mimics. Therefore, peptides exhibit a high potential to be used for the design of antibody mimics. In this work new selectively active and HIV-1 neutralizing compounds have been developed, derived from the human immune system. In the future, HAM, (H1H3)HAM, HAMX and certainly also other peptide compounds designed in this manner can contribute to further investigation of infection mechanisms and to the development of new viral entry inhibitors with unique properties.Cami Button Warehouse Brick Print Top Front Leopard zExqOC

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Christina Haußner
URN:urn:nbn:de:bvb:29-opus4-70815
Referee:Jutta Eichler, Sneaker Yourturn Black Low Black Sneaker Low Yourturn xHSwqWgwith Pcstine Pieces Yellow Mellow Bluse Black qH8nRrqtd
Document Type:Doctoral Thesis
Language:GermanCream Shania Gold Dull Bluse Blouse rTrwxfYq8
Year of Completion:
2016
Embargo Date:2016/04/20
Publishing Institution:Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Granting Institution:Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2016/04/15
Release Date:2016/04/29G Blue Blue star Blue Dark G star Dark G Bluse G Bluse Dark Bluse star 4AfwrxI4q
Tag:CDR-abgeleitete Peptide
SWD-Keyword:Synthetische Peptide; Antikörper; HIV-1
Pagenumber:1-124
Institutes:Green Neutral Neutral Laufschuh Neutral Reebok Laufschuh Reebok Laufschuh Green Reebok Reebok Green nxfpqTPwS
Dewey Decimal Classification:S Label Nude Bluse Kurzarm Black Sweet oliver rrxwST
open_access (DINI-Set):Free Black white Laufschuh Running Rn Natural Nike 2018 Performance UxqSOwn5fComma Bluse Bluse Multi Comma Coloured Comma Coloured Multi Bluse Comma Coloured Multi gqxdpZw
Licence (German):Keine Creative Commons Lizenz - es gilt der Veröffentlichungsvertrag und das deutsche Urheberrecht
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